Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPRED1: sc-402981-ACT

SPRED1 (protéine 1 contenant un domaine EVH1 apparentée aux sprouty) est un régulateur négatif de la signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase, qui atténue la cascade RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK en recrutant la neurofibromine (NF1) et en limitant l’activation d’ERK en aval. Par ce rôle inhibiteur, SPRED1 contribue à contrôler la prolifération cellulaire, la différenciation et la réactivité aux facteurs de croissance dans de multiples tissus. Une altération génétique ou une diminution de l’activité de SPRED1 est associée à une dérégulation de la signalisation MAPK et est impliquée dans des troubles neurocutanés du développement tels que le syndrome de Legius, avec une pertinence plus large dans les contextes où une activité anormale de la voie RAS/MAPK modifie les phénotypes cellulaires. SPRED1 constitue donc un nœud utile pour disséquer le contrôle par rétroaction et l’ajustement fin des voies de signalisation dans la biologie dépendante des MAPK.

SPRED1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPRED1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPRED1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPRED1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPRED1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPRED1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPRED1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPRED1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPRED1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPRED1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.