SP-lyase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402278-ACT

O SGPL1 humano codifica a liasa de esfingosina-1-fosfato (SP-liase), uma enzima associada ao retículo endoplasmático que degrada irreversivelmente a esfingosina-1-fosfato (S1P) em fosfoetanolamina e um aldeído de cadeia longa, encerrando assim a sinalização de S1P. Ao controlar o equilíbrio entre S1P e ceramida/esfingosina, o SGPL1 regula a homeostase dos esfingolipídios e influencia vias ligadas à sobrevivência celular, à sinalização inflamatória e a respostas de estresse mediadas por lipídios. A atividade do SGPL1 afeta o tráfego de células imunes e a biologia vascular por meio da modulação de gradientes de S1P e da sinalização dependente de receptores. Alterações na função do SGPL1 e a perturbação do metabolismo de esfingolipídios têm sido associadas a distúrbios congênitos multissistêmicos e a fenótipos mais amplos envolvendo esteroidogênese, neurodesenvolvimento e função renal, tornando-o um alvo importante para estudos mecanísticos em sinalização lipídica.

SP-lyase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SGPL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SP-lyase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SGPL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SGPL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SP-lyase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SGPL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SP-lyase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SP-lyase em células tumorais com expressão de SGPL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.