Smad7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400251-ACT

O SMAD7 codifica a Smad7, uma SMAD inibitória que atua como um importante regulador negativo das vias de sinalização de TGF-β e BMP, ao interferir na fosforilação de R-SMADs mediada por receptores e ao promover a redução (downregulation) desses receptores. Por meio da modulação de programas transcricionais dependentes de SMAD, a Smad7 influencia a transição epitélio–mesênquima, a remodelação da matriz extracelular, o controle do ciclo celular e a comunicação cruzada com a sinalização inflamatória. Alterações na expressão de SMAD7 têm sido associadas a respostas fibróticas desreguladas, comprometimento da homeostase imune e controle de crescimento aberrante em múltiplos contextos teciduais. Essas conexões de via tornam o SMAD7 um alvo útil para dissecar a regulação por feedback nas redes de TGF-β/BMP e suas saídas transcricionais a jusante.

Smad7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMAD7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Smad7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMAD7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMAD7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Smad7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMAD7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Smad7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Smad7 em células tumorais com expressão de SMAD7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.