Separase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404170-ACT

ESPL1 codifica a separase, uma endopeptidase de cisteína que desencadeia a separação das cromátides-irmãs na anáfase ao clivar componentes do complexo coesina, permitindo a segregação correta dos cromossomos durante a mitose e a meiose. A atividade da separase é rigidamente controlada pela ligação à securina e por fosforilação inibitória até ser ativada por proteólise dependente do APC/C, coordenando a transição metáfase–anáfase e a conclusão da citocinese. A expressão desregulada de ESPL1 ou a hiperatividade da separase pode promover instabilidade cromossômica e aneuploidia, ligando essa via a defeitos de manutenção do genoma observados em múltiplos contextos de câncer. ESPL1 também é usado como um nó mecanístico para estudar o controle do checkpoint de montagem do fuso, o timing do ciclo celular e a dinâmica de estabelecimento/remoção da coesão.

Separase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ESPL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Separase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ESPL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ESPL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Separase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ESPL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Separase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Separase em células tumorais com expressão de ESPL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.