SAS-6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401644-ACT

O SASS6 humano codifica a SAS-6, um componente central do “cartwheel” centriolar, necessário para a simetria de nove dobras durante a biogênese do centríolo. A SAS-6 coordena a formação do procentríolo e a duplicação do centríolo, sustentando a integridade do centrossoma, a organização dos microtúbulos e a montagem correta do fuso mitótico ao longo do ciclo celular. A desregulação da SAS-6 está associada à amplificação de centrossomas, instabilidade cromossômica e a programas de proliferação alterados, frequentemente estudados no câncer e em outras patologias relacionadas ao ciclo celular. Como fator de centrossomo/centríolo, a SAS-6 também é relevante para modelos de defeitos de ciliogênese e fenótipos de desenvolvimento correlatos, decorrentes de comprometimento da função do corpo basal.

SAS-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SASS6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SAS-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SASS6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SASS6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SAS-6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SASS6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SAS-6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SAS-6 em células tumorais com expressão de SASS6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.