Plasmide CRISPR d'Activation (r) Rock-2: sc-437370-ACT

La protéine kinase 2 associée à Rho (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2 ; ROCK2 ; Rock-2) est une kinase sérine/thréonine agissant en aval de RhoA pour réguler la contractilité actomyosine, la formation de fibres de stress, la dynamique des adhésions focales et le remodelage du cytosquelette. Par la phosphorylation de substrats tels que la chaîne légère de la myosine et les kinases LIM, ROCK2 intègre la signalisation Rho/ROCK à des voies contrôlant la forme cellulaire, la motilité, la rétraction des neurites et le tonus du muscle lisse. Dans des modèles chez le rat, une activité altérée de ROCK2 est fréquemment étudiée dans le contexte du remodelage vasculaire, de la fibrose, de la neuroinflammation et des réponses aux lésions, où une tension cytosquelettique aberrante et la migration cellulaire contribuent à la pathologie. La signalisation dépendante de ROCK2 est également pertinente pour la mécanotransduction et les transitions de type épithélio-mésenchymateux dans divers tissus, ce qui en fait un nœud utile pour disséquer des phénotypes induits par la contractilité.

Rock-2 Le plasmide d'activation CRISPR (r) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rock-2 Le plasmide d'activation CRISPR (r) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription , où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rock-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rock-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rock-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.