Rock-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (r): sc-437370-ACT

A proteína quinase 2 contendo domínio coiled-coil associada a Rho (ROCK2; Rock-2) é uma quinase de serina/treonina que atua a jusante de RhoA para regular a contratilidade actomiosina, a formação de fibras de estresse, a dinâmica das adesões focais e a remodelação do citoesqueleto. Por meio da fosforilação de substratos como a cadeia leve de miosina e as quinases LIM, a ROCK2 integra a sinalização Rho/ROCK a vias que controlam a forma celular, a motilidade, a retração de neuritos e o tônus do músculo liso. Em modelos de rato, a atividade alterada de ROCK2 é frequentemente estudada no contexto de remodelamento vascular, fibrose, neuroinflamação e respostas a lesões, nas quais a tensão citosquelética aberrante e a migração celular contribuem para a patologia. A sinalização dependente de ROCK2 também é relevante para a mecanotransdução e para transições do tipo epitelial–mesenquimal em diversos tecidos, sustentando seu uso como um nó para dissecar fenótipos impulsionados pela contratilidade.

Rock-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (r) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rock-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (r) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição , onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rock-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rock-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rock-2 em células tumorais com expressão de silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.