Plasmide CRISPR d'Activation (m) Rock-2: sc-422695-ACT

Mouse Rock2 code la protéine kinase 2 associée à Rho contenant des domaines coiled-coil (ROCK2), une kinase sérine/thréonine qui constitue un effecteur principal de RhoA pour contrôler la contractilité actomyosine, la formation de fibres de stress et la dynamique des adhésions focales. ROCK2 phosphoryle des substrats tels que MYPT1 et LIMK, régulant l’activité de la chaîne légère de la myosine et le remodelage de l’actine dépendant de la cofiline afin d’influencer la forme cellulaire, la polarité et la migration. Via ces programmes cytosquelettiques, Rock2 contribue à des processus incluant la cytocinèse, la croissance des neurites et le tonus du muscle lisse vasculaire, et est fréquemment étudié dans le contexte de la fibrose, de l’inflammation, des maladies neurodégénératives, ainsi que de l’invasion et des métastases liées au cancer. Sa connectivité de voie avec la signalisation des GTPases Rho et la mécanotransduction fait de Rock2 un nœud largement utilisé pour disséquer la manière dont la tension du cytosquelette s’interface avec des signaux transcriptionnels et des signaux issus de la matrice extracellulaire.

Rock-2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rock2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rock-2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rock2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rock2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rock-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rock2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rock-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rock-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Rock2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.