Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ribophorin I: sc-402286-ACT

RPN1 code la ribophorine I, un composant essentiel du complexe oligosaccharyltransférase (OST) intégré à la membrane du réticulum endoplasmique rugueux, qui assure la N‑glycosylation co‑traductionnelle liée à l’azote des protéines sécrétoires naissantes et des protéines membranaires. En coordonnant le transfert des glycannes et la maturation des protéines, la ribophorine I contribue à la protéostasie du RE, au contrôle qualité et au trafic le long de la voie sécrétoire, avec des répercussions en aval sur la signalisation des récepteurs et la composition du protéome de surface cellulaire. Une capacité de glycosylation du RE altérée et une dérégulation des sous-unités de l’OST ont été associées à des réponses au stress cellulaire et à un traitement anormal des protéines observés dans de multiples contextes pertinents pour les maladies, faisant de RPN1 un nœud utile pour étudier la biogenèse des glycoprotéines. La modulation expérimentale de l’expression de RPN1 permet d’examiner comment la machinerie de glycosylation résidente du RE façonne l’efficacité du repliement, la dégradation via la dégradation associée au RE (ERAD) et, plus largement, la stabilité du protéome.

Ribophorin I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ribophorin I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ribophorin I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ribophorin I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ribophorin I dans les cellules tumorales présentant une expression de RPN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.