Riboflavin kinase CRISPR Activationプラスミド (h): sc-418359-ACT

ヒトRFKはリボフラビンキナーゼをコードしており、細胞質に存在する酵素としてリボフラビン（ビタミンB2）をリン酸化し、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）の重要な前駆体であるフラビンモノヌクレオチド（FMN）を生成します。細胞内のFMN/FADの利用可能量を制御することで、RFKはフラボタンパク質依存性の酸化還元代謝、ミトコンドリアの酸化的リン酸化、ならびに活性酸素種（ROS）の処理に影響する抗酸化防御経路を支えています。リボフラビン利用やフラビン補酵素の恒常性の乱れは、実験系において代謝ストレス表現型や、神経変性および心代謝機能障害への感受性と関連づけられています。そのためRFKの発現は、ビタミン補酵素代謝、ミトコンドリアのバイオエネルギー、そしてレドックス制御シグナル伝達を研究するうえで有用な指標（切り口）となります。

Riboflavin kinase CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RFKの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Riboflavin kinase CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RFK 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRFK転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Riboflavin kinaseの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRFK遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRiboflavin kinase依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRFK発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRiboflavin kinase経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。