Plasmide CRISPR d'Activation (h) RBM35B: sc-408008-ACT

L’ESRP2 humain (RBM35B) code une protéine épithéliale régulatrice de l’épissage qui se lie au pré‑ARNm et dirige des programmes d’épissage alternatif contribuant au maintien de l’identité épithéliale et de l’architecture des jonctions cellule–cellule. En régulant des isoformes d’épissage dans des voies impliquées dans la dynamique du cytosquelette, les jonctions d’adhérence et la transition épithélio‑mésenchymateuse (TEM/EMT), ESRP2 participe à un contrôle dépendant du contexte de la différenciation, de la migration et des sorties de signalisation. Des altérations de l’expression d’ESRP2 ou de son activité d’épissage ont été associées à des transcriptomes aberrants liés à l’EMT ainsi qu’à une dérégulation du traitement de l’ARN observées dans de multiples modèles tumoraux et du développement. En tant que nœud reliant la spécificité de liaison à l’ARN à une régulation génique résolue au niveau des isoformes, ESRP2 est largement utilisé pour étudier les changements phénotypiques induits par l’épissage et le remaniement des voies de signalisation.

RBM35B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ESRP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RBM35B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ESRP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ESRP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RBM35B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ESRP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RBM35B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RBM35B dans les cellules tumorales présentant une expression de ESRP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.