Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 3A: sc-402633-ACT

RAB3A code la petite GTPase Rab3A, un régulateur de l’exocytose Ca²⁺‑dépendante associé aux vésicules synaptiques, qui coordonne l’arrimage, la préparation (priming) et la fusion des vésicules au niveau des terminaisons présynaptiques. En alternant entre des états liés au GDP et au GTP, Rab3A s’intègre aux réseaux d’effecteurs Rab et à la machinerie associée aux SNARE pour contrôler la libération de neurotransmetteurs et le trafic vésiculaire dépendant de l’activité. Ces processus relient RAB3A à la signalisation neuronale, à la plasticité synaptique et aux voies de sécrétion régulée dans des contextes neuroendocriniens. La dérégulation du trafic vésiculaire et de la dynamique de libération synaptique est pertinente pour les mécanismes des maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, ce qui fait de RAB3A une cible d’intérêt pour l’étude de la fonction présynaptique.

Rab 3A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 3A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 3A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 3A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 3A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.