PRP8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402819-ACT

PRPF8 codifica a PRP8, um componente central altamente conservado da pequena ribonucleoproteína nuclear U5 dentro do spliceossomo do tipo U2, onde ajuda a coordenar a formação do centro catalítico e a ligação de éxons durante o splicing do pré‑mRNA. Por meio de suas extensas interações com RNAs e proteínas do spliceossomo, a PRP8 sustenta o reconhecimento dos sítios de splicing, a dinâmica de montagem do spliceossomo e a integridade do transcriptoma em diversos programas gênicos. A perturbação da função de PRPF8 pode desorganizar padrões de splicing alternativo, levando a alterações amplas no processamento de RNA e em vias a jusante ligadas ao controle do ciclo celular, respostas a danos no DNA e proteostase. A atividade aberrante do spliceossomo envolvendo PRPF8 tem sido associada a distúrbios hereditários da retina e tem sido estudada no contexto da desregulação do spliceossomo observada em neoplasias e outras doenças caracterizadas por processamento de RNA alterado.

PRP8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRPF8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PRP8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRPF8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRPF8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PRP8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRPF8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PRP8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PRP8 em células tumorais com expressão de PRPF8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.