Plasmide CRISPR d'Activation (h) PRP8: sc-402819-ACT

PRPF8 code PRP8, un composant central hautement conservé de la petite ribonucléoprotéine nucléaire U5 au sein du spliceosome de type U2, où il contribue à coordonner la formation du centre catalytique et la ligature des exons lors de l’épissage du pré-ARNm. Grâce à ses interactions étendues avec les ARN et les protéines du spliceosome, PRP8 soutient la reconnaissance des sites d’épissage, la dynamique d’assemblage du spliceosome et l’intégrité du transcriptome à travers divers programmes géniques. Une perturbation de la fonction de PRPF8 peut désorganiser les profils d’épissage alternatif, entraînant des modifications étendues du traitement de l’ARN et des voies en aval liées au contrôle du cycle cellulaire, aux réponses aux dommages de l’ADN et à la protéostasie. Une activité aberrante du spliceosome impliquant PRPF8 a été associée à des affections rétiniennes héréditaires et a été étudiée dans le contexte de la dérégulation du spliceosome observée dans les cancers et d’autres maladies caractérisées par un traitement de l’ARN altéré.

PRP8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRPF8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRP8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRPF8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRPF8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRP8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRPF8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRP8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRP8 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRPF8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.