Plasmide CRISPR d'Activation (m) Pre-TCRα: sc-422473-ACT

Le gène murin **Ptcra** code la chaîne alpha du pré-récepteur des cellules T (Pre‑TCRα), un composant essentiel du complexe pré‑TCR qui s’associe à TCRβ pour former un récepteur capable de transmettre un signal au cours des premières étapes du développement des thymocytes. La signalisation induite par Pre‑TCRα coordonne la β‑sélection, la survie et la prolifération des thymocytes DN3/DN4, en s’intégrant aux signaux proximaux LCK/FYN–ZAP70/SYK, aux voies d’adaptateurs LAT/SLP‑76, ainsi qu’aux programmes en aval MAPK et NF‑κB. En gouvernant la transition vers les stades immature simple positif et double positif, l’expression de **Ptcra** façonne la formation du répertoire des cellules T et la progression des lignées. La perturbation de la signalisation du pré‑TCR est largement utilisée comme modèle pour étudier les défauts du développement thymique, les anomalies de différenciation lymphoïde et les mécanismes contribuant à la dérégulation immunitaire.

Pre-TCRα Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ptcra sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pre-TCRα Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ptcra dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ptcra, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pre-TCRα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ptcra natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pre-TCRα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pre-TCRα dans les cellules tumorales présentant une expression de Ptcra silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.