PP2A-B55-δ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404806-ACT

PPP2R2D kodiert die regulatorische Untereinheit B55δ der Proteinphosphatase 2A (PP2A), einer wichtigen Serin/Threonin-Phosphatase, die die Signalübertragung feinabstimmt, indem sie die katalytische PP2A-Aktivität gezielt auf bestimmte Substrate lenkt. PP2A‑B55δ trägt zur Kontrolle des Zellzyklusfortschritts und zur Erholung von Checkpoints bei, indem sie die Phosphorylierungsdynamik beim mitotischen Austritt und bei anderen phosphorylierungsabhängigen Übergängen reguliert, mit nachgelagerten Effekten auf Proliferation und Stressantworten. Durch die Einbindung in kinasengetriebene Signalwege, einschließlich Netzwerken, die mit der MAPK- sowie der PI3K/AKT-Signalgebung verknüpft sind, kann eine veränderte PPP2R2D-Expression oder ein verschobenes Gleichgewicht der PP2A‑B55δ‑Komplexe den Zustand des Phosphoproteoms umgestalten. Eine Fehlregulation der Zusammensetzung des PP2A-Holoenzyms wird in der Krebsbiologie und Neurobiologie häufig als Mechanismus untersucht, der genomische Stabilität, Differenzierung und neuronale Signalübertragung beeinflusst.

PP2A-B55-δ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP2R2D-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PP2A-B55-δ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP2R2D-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP2R2D-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PP2A-B55-δ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP2R2D-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PP2A-B55-δ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PP2A-B55-δ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP2R2D-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.