PNGase Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h): sc-406323

Visão geral

O NGLY1 humano codifica a peptídeo:N-glicanase (PNGase), uma enzima citosólica de desglicosilação que remove glicanos ligados a N de glicoproteínas mal dobradas após a sua retrotranslocação do retículo endoplasmático. Essa atividade dá suporte à degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD) e à proteostase ao preparar os substratos para a degradação pelo proteassoma, conectando a função do NGLY1 a vias de controle de qualidade dependentes de ubiquitina. O NGLY1 também influencia respostas celulares ao estresse e redes de homeostase proteica, incluindo processos acoplados à resposta a proteínas mal dobradas e à vigilância de glicoproteínas. A disfunção do NGLY1 tem sido associada a um distúrbio congênito raro de desglicosilação e a fenótipos mais amplos compatíveis com proteostase comprometida, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos de ERAD e do metabolismo de glicoproteínas.

O PNGase CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene NGLY1 em human linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus NGLY1, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o PNGase Plasmídeo HDR (h) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido NGLY1.
Quando co-transfectado com o PNGase Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto NGLY1.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus NGLY1 e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) NGLY1 crítico(s) para a função PNGase
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.