PHD3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-431083-ACT

O Egln3 de camundongo codifica a proteína 3 contendo domínio de hidroxilase de prolina (PHD3), uma enzima sensora de oxigênio que hidroxila subunidades HIF-α e promove sua ubiquitinação dependente de VHL e sua degradação pelo proteassoma. Por meio da regulação de programas transcricionais do HIF, a PHD3 influencia vias responsivas à hipóxia que controlam a angiogênese, a adaptação metabólica, a eritropoiese e a sinalização inflamatória. A atividade de Egln3 também se cruza com processos de resposta ao estresse e apoptose, contribuindo para decisões de destino celular sob limitação de nutrientes ou oxigênio. A desregulação da sinalização do eixo PHD3/HIF está implicada em fenótipos induzidos por hipóxia relevantes para a biologia tumoral, modelos de lesão isquêmica e mecanismos de doenças inflamatórias crônicas, tornando o Egln3 um nó útil para a dissecação de vias in vivo e em células de camundongo cultivadas.

HIF PHD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Egln3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HIF PHD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Egln3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Egln3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HIF PHD3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Egln3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HIF PHD3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HIF PHD3 em células tumorais com expressão de Egln3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.