PARD6A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401184-ACT

PARD6A codifica a proteína “partitioning defective 6 homolog alpha”, um componente central do complexo de polaridade PAR, que coopera com PAR3 e a PKC atípica para estabelecer a polaridade ápico-basal e regular a divisão celular assimétrica. Por meio da coordenação da montagem das junções estreitas, da organização do citoesqueleto e do tráfego vesicular, PARD6A influencia a morfogênese epitelial, a migração celular e a manutenção da arquitetura de tecidos diferenciados. A perturbação da sinalização do complexo PAR tem sido associada à perda da integridade das junções e a programas de proliferação alterados, processos frequentemente ligados à tumorigênese e à progressão metastática. Assim, PARD6A é amplamente estudado em modelos de perda de polaridade epitelial, invasão e “cross-talk” de sinalização envolvendo pequenas GTPases e vias de quinases que controlam a arquitetura celular.

PARD6A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PARD6A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PARD6A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PARD6A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PARD6A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PARD6A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PARD6A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PARD6A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PARD6A em células tumorais com expressão de PARD6A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.