Paraxis Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403926-ACT

O TCF15 humano codifica Paraxis, um fator de transcrição do tipo hélice–alça–hélice básica (bHLH) que coordena o padrão do mesoderma paraxial e a compartimentalização dos somitos durante a embriogênese. Paraxis regula programas de linhagem que governam a diferenciação miogênica e condrogênica, coordenando redes transcricionais envolvidas na epitelização, no compromisso de destino celular e na morfogênese tecidual. Pelo seu papel na regulação gênica do desenvolvimento, o TCF15 é estudado em vias que moldam a formação musculoesquelética e em modelos de estados de diferenciação aberrantes relevantes para defeitos congênitos do desenvolvimento e para a reprogramação transcricional associada ao câncer. A expressão desregulada de TCF15 foi relatada em múltiplos contextos tumorais, motivando seu uso como um nó para dissecar o controle transcricional específico de contexto e as transições de identidade celular.

Paraxis O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TCF15 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Paraxis O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TCF15 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TCF15, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Paraxis. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TCF15 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Paraxis no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Paraxis em células tumorais com expressão de TCF15 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.