PAR-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400333-ACT

F2RL1 codifica o receptor ativado por protease 2 (PAR-2), um receptor acoplado à proteína G ativado pela clivagem por proteases de serina, que desmascara um ligante ancorado e inicia a sinalização intracelular. O PAR-2 acopla-se a Gαq/11, Gαi/o e Gα12/13 para regular o fluxo de Ca2+ mediado pela fosfolipase C, a remodelação do citoesqueleto via RhoA, as cascatas MAPK/ERK e a transcrição dirigida por NF-κB, moldando assim respostas inflamatórias e de barreira. Esse receptor é amplamente expresso em compartimentos epiteliais e endoteliais, bem como em células imunes, conectando a atividade extracelular de proteases à liberação de citocinas, ao tráfego de leucócitos e à sinalização nociceptiva. A sinalização desregulada de PAR-2 tem sido implicada em inflamação crônica, fibrose, hiper-reatividade das vias aéreas, prurido e remodelação do microambiente associado a tumores, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos de vias impulsionadas por proteases.

PAR-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de F2RL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAR-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus F2RL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição F2RL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAR-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus F2RL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAR-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAR-2 em células tumorais com expressão de F2RL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.