PAF-R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402569-ACT

PTAFR codifica o recetor do fator ativador de plaquetas (PAF-R), um GPCR de classe A que se liga ao fator ativador de plaquetas e acopla-se principalmente às vias de sinalização de Gαq/11 e Gαi para regular a ativação da fosfolipase C, o fluxo intracelular de Ca²⁺ e programas transcricionais a jusante mediados por MAPK e NF-κB. A atividade do PAF-R integra a deteção de mediadores lipídicos inflamatórios com a quimiotaxia de leucócitos, a ativação endotelial e a modulação de redes de citocinas e eicosanoides, influenciando as respostas imunitárias inatas e a permeabilidade vascular. A sinalização desregulada de PTAFR/PAF-R tem sido associada a processos inflamatórios e alérgicos, à ativação imunitária associada a infeções e à biologia do microambiente tumoral, através de efeitos no comportamento de células mieloides e na função de barreira. Sendo um recetor de membrana com sinalização rápida induzida por ligando, constitui um alvo acessível para dissecar a inflamação mediada por GPCR e a comunicação cruzada com a sinalização lipídica.

PAF-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PTAFR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAF-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PTAFR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PTAFR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAF-R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PTAFR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAF-R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAF-R em células tumorais com expressão de PTAFR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.