P-cadherin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400507-ACT

CDH3 codifica la P-caderina, una caderina classica che media l’adesione cellula–cellula calcio-dipendente tramite le giunzioni aderenti e regola l’architettura dei tessuti epiteliali. Attraverso il legame omofilico e l’accoppiamento alle catenine e al citoscheletro di actina, la P-caderina influenza la polarità cellulare, la migrazione collettiva e la stabilità delle giunzioni, intersecando vie quali la segnalazione Wnt/β-catenina e la plasticità epitelio–mesenchimale. Un’espressione disregolata di CDH3 è associata ad alterazioni della dinamica di adesione e a fenotipi invasivi in molteplici tumori epiteliali, e varianti germinali sono state collegate a disturbi dello sviluppo che interessano i tessuti ectodermici e la visione. Queste proprietà rendono CDH3 un nodo utile per studiare la segnalazione dipendente dall’adesione, la morfogenesi tissutale e comportamenti di tipo metastatico in modelli cellulari umani.

P-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDH3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDH3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDH3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P-cadherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDH3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P-cadherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P-cadherin nelle cellule tumorali con espressione di CDH3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.