Plasmide CRISPR d'Activation (h) OTC: sc-402611-ACT

L’ornithine transcarbamylase (OTC) est une enzyme mitochondriale qui catalyse la conversion de l’ornithine et du phosphate de carbamoyle en citrulline, une étape clé du cycle de l’urée hépatique responsable de la détoxification de l’ammoniac. En régulant l’élimination de l’azote, l’activité de l’OTC influence l’équilibre azoté cellulaire, le métabolisme mitochondrial et l’homéostasie des acides aminés, avec des effets en aval sur le stress oxydatif et l’état bioénergétique. Le dérèglement de l’OTC est associé à l’hyperammoniémie et aux erreurs innées du métabolisme, et des altérations du flux du cycle de l’urée ont été étudiées dans des contextes de reprogrammation métabolique et de dysfonction mitochondriale. L’OTC humaine constitue donc un nœud d’intérêt pour disséquer le contrôle du cycle de l’urée, la gestion de l’azote et les réponses au stress associées aux mitochondries dans les hépatocytes et des systèmes modèles pertinents pour le foie.

OTC Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OTC sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OTC Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OTC dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OTC, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OTC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OTC natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OTC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OTC dans les cellules tumorales présentant une expression de OTC silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.