ORMDL1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403586-ACT

ORMDL1（orosomucoid-like 1）は小胞体（ER）に局在する膜タンパク質で、デノボ・セラミド合成の律速酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（SPT）を阻害することにより、スフィンゴ脂質恒常性を制御する保存的な調節因子として機能します。セラミドおよびスフィンゴミエリンのプールを調整することで、ORMDL1は膜組成、ERストレス応答、ならびに細胞増殖や炎症経路に関連する下流シグナル伝達過程に影響を及ぼします。スフィンゴ脂質代謝の破綻とERストレスは心代謝系および免疫関連の表現型に関与することが示唆されており、ORMDL1は脂質駆動性シグナルの機序研究における重要な解析ノードとなります。がん生物学やストレス適応の文脈では、ORMDL1発現の変化が、細胞種依存的に増殖・遊走・生存プログラムの変化と関連することが報告されています。

ORMDL1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ORMDL1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

ORMDL1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ORMDL1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はORMDL1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性ORMDL1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のORMDL1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるORMDL1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびORMDL1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるORMDL1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。