O-GlcNAc transferase Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-430829-ACT

Ogt codifica a O-GlcNAc transferase (OGT), a enzima nucleocitoplasmática essencial que catalisa a adição de β-N-acetilglucosamina ligada por O (O-GlcNAc) a resíduos de serina/treonina em diversos substratos proteicos. Essa modificação pós-traducional dinâmica integra o estado nutricional celular por meio da via biossintética da hexosamina e molda a sinalização, a transcrição, a regulação da cromatina, a proteostase e o controle do ciclo celular. A O-GlcNAcilação mediada por OGT interage com a fosforilação para ajustar finamente cascatas de quinases e programas responsivos ao estresse, influenciando a diferenciação e a função neuronal. A desregulação do ciclo de O-GlcNAc tem sido associada a mecanismos de doenças metabólicas e neurodegenerativas, bem como a redes de sinalização oncogênica, tornando Ogt um nó central para estudos focados em vias em sistemas murinos.

O-GlcNAc transferase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ogt sem alterar a sequência de ADN subjacente.

O-GlcNAc transferase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ogt em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ogt, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de O-GlcNAc transferase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ogt nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de O-GlcNAc transferase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via O-GlcNAc transferase em células tumorais com expressão de Ogt silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.