Plasmide CRISPR d'Activation (m) Nix: sc-419357-ACT

Bnip3l (Nix) est une protéine de la membrane externe mitochondriale qui agit comme récepteur d’autophagie sélective, reliant les mitochondries endommagées aux autophagosomes positifs pour LC3 via son motif LIR. Dans les cellules murines, Nix participe au contrôle qualité des mitochondries, à la signalisation associée à l’apoptose et aux voies de réponse à l’hypoxie, en intégrant des signaux qui influencent le métabolisme oxydatif et la survie cellulaire. Elle est bien connue pour ses rôles dans la mitophagie programmée lors de la maturation érythroïde et pour la régulation du renouvellement mitochondrial dans des tissus soumis à un stress métabolique. Dans des modèles expérimentaux, une activité dérégulée de BNIP3L/Nix a été associée à des altérations de l’homéostasie mitochondriale et à des décisions de destin cellulaire pertinentes pour la neurodégénérescence, les réponses cardiaques au stress et la biologie du cancer.

Nix Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Bnip3l sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nix Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Bnip3l dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Bnip3l, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nix. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Bnip3l natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nix au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nix dans les cellules tumorales présentant une expression de Bnip3l silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.