Nebulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404182-ACT

Il gene umano **NEB** codifica la nebulina, una gigantesca proteina filamentosa di impalcatura dei filamenti sottili del muscolo scheletrico che stabilizza l’F-actina, definisce la lunghezza del filamento e supporta l’allineamento dei sarcomeri e la trasmissione della forza. La nebulina interagisce con i complessi regolatori troponina–tropomiosina e con componenti del disco Z, collegando l’attivazione contrattile all’organizzazione del citoscheletro durante la miofibrillogenesi e il mantenimento muscolare. Alterazioni dell’espressione o della funzione di **NEB** sono associate a miopatie strutturali, inclusa la miopatia nemalinica, e sono rilevanti per studi su debolezza muscolare, rimodellamento dei tipi di fibra e meccanobiologia dipendente dall’actina. Queste caratteristiche rendono **NEB** un bersaglio centrale per investigare l’assemblaggio del sarcomero, gli esiti dell’accoppiamento eccitazione–contrazione e la dinamica del citoscheletro di actina in modelli di muscolo umano.

Nebulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nebulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nebulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nebulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nebulin nelle cellule tumorali con espressione di NEB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.