ML-IAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403976-ACT

BIRC7 codifica ML-IAP (nota anche come livin), un membro della famiglia proteica degli inibitori dell’apoptosi (IAP) che sopprime la morte cellulare programmata legandosi e inibendo le caspasi effettrici come CASP3, CASP7 e CASP9. Attraverso i suoi domini BIR e RING, ML-IAP può modulare la segnalazione apoptotica e il turnover proteico dipendente dall’ubiquitina, plasmando le risposte cellulari a stimoli di morte intrinseci ed estrinseci. Un’espressione deregolata di BIRC7 è stata associata alla resistenza all’apoptosi e ad alterazioni della segnalazione dello stress in molteplici contesti oncologici, sostenendone l’impiego come nodo meccanicistico negli studi delle vie di sopravvivenza. In ambito di ricerca, ML-IAP viene spesso analizzata insieme alla segnalazione TNF, alla regolazione dell’apoptosi mitocondriale e alle reti cellulari di proteostasi.

ML-IAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BIRC7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ML-IAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BIRC7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BIRC7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ML-IAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BIRC7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ML-IAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ML-IAP nelle cellule tumorali con espressione di BIRC7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.