MGP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401556-ACT

A MGP (proteína Gla da matriz) humana é uma proteína secretada da matriz extracelular dependente de vitamina K, mais conhecida por inibir a mineralização ectópica ao ligar-se ao cálcio e regular a deposição de hidroxiapatita. É altamente relevante para a biologia vascular, onde modula programas de sinalização osteogénica em células musculares lisas vasculares e interage com vias relacionadas com BMP/TGF-β que governam a calcificação, a remodelação e a homeostase da matriz extracelular. A expressão desregulada de MGP ou o seu estado de carboxilação está associado a fenótipos de calcificação patológica observados em contextos cardiovasculares e do tecido conjuntivo, tornando-a uma ferramenta molecular útil para estudar mecanismos de controlo da calcificação. Como fator circulante e associado à matriz, a MGP também é utilizada como um gene ligado a biomarcadores em estudos mecanísticos do metabolismo mineral e do envelhecimento dos tecidos.

MGP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MGP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MGP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MGP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MGP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MGP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MGP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MGP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MGP em células tumorais com expressão de MGP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.