MEL-1B-R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401526-ACT

MTNR1B codifica o recetor humano de melatonina 1B (MEL-1B-R), um recetor acoplado à proteína G (GPCR) do tipo rodopsina que transduz sinais de melatonina para regular o timing circadiano e a fisiologia dependente do fotoperíodo. A ativação do recetor acopla-se principalmente a proteínas Gi/o para modular a atividade da adenilato ciclase, a sinalização cAMP/PKA e programas de transcrição a jusante que coordenam ritmos metabólicos celulares. A atividade de MTNR1B está ligada à regulação endócrina e metabólica, incluindo a função das ilhotas pancreáticas e a homeostase da glicose, tornando-o relevante para estudos da interação entre ritmos circadianos e metabolismo. Variações genéticas e de expressão em MTNR1B têm sido associadas a alterações em características glicémicas e à suscetibilidade a disfunção metabólica, sustentando a sua utilização como um nó mecanístico em cronobiologia e investigação cardiometabólica.

MEL-1B-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTNR1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MEL-1B-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTNR1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTNR1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MEL-1B-R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTNR1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MEL-1B-R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MEL-1B-R em células tumorais com expressão de MTNR1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.