Plasmide CRISPR d'Activation (h) MECL-1: sc-402101-ACT

PSMB10 code MECL-1, une sous-unité β inductible de l’immunoprotéasome qui remplace des composants constitutifs du protéasome en réponse à des signaux inflammatoires tels que l’interféron-γ. MECL-1 contribue au renouvellement des protéines dépendant de l’ubiquitine et module le traitement des antigènes du CMH de classe I en influençant la génération d’épitopes peptidiques présentés aux lymphocytes T CD8+. Par son rôle dans la protéostasie et la surveillance immunitaire, une composition altérée de l’immunoprotéasome peut affecter la signalisation inflammatoire, la dynamique de présentation antigénique et les réponses au stress cellulaire. La dérégulation des sous-unités de l’immunoprotéasome, dont MECL-1, a été associée, dans des contextes de recherche translationnelle, à des pathologies à médiation immunitaire et à des mécanismes d’échappement immunitaire liés au cancer.

MECL-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PSMB10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MECL-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PSMB10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PSMB10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MECL-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PSMB10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MECL-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MECL-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PSMB10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.