Plasmide CRISPR d'Activation (h) MAN1B1: sc-405117-ACT

MAN1B1 code la mannosyl-oligosaccharide 1,2-α-mannosidase du réticulum endoplasmique (MAN1B1), une enzyme clé de l’élagage (trimming) des N-glycanes qui aide à orienter les glycoprotéines mal repliées vers la dégradation associée au RE (ERAD). En traitant les résidus mannose des N-glycanes nouvellement formés, MAN1B1 contribue au contrôle qualité des glycoprotéines, à la protéostasie et au bon trafic via la voie sécrétoire. Une dérégulation de l’activité de MAN1B1 a été associée à des troubles congénitaux de la glycosylation, où une maturation altérée des N-glycanes peut perturber la maturation des récepteurs de surface, la signalisation et l’homéostasie intracellulaire. Ainsi, MAN1B1 est fréquemment étudiée dans le contexte des réponses au stress du RE, de la dynamique du repliement des protéines et de la modulation de la physiologie cellulaire dépendante des glycanes.

MAN1B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAN1B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MAN1B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAN1B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAN1B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MAN1B1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAN1B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MAN1B1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MAN1B1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAN1B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.