MAN1B1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405117-ACT

MAN1B1 codifica a α-manosidase 1,2 do retículo endoplasmático específica para mannosil-oligossacarídeos (MAN1B1), uma enzima-chave no aparo (“trimming”) de N-glicanos que ajuda a direcionar glicoproteínas mal dobradas para a degradação associada ao RE (ERAD). Ao processar resíduos de manose em N-glicanos recém-formados ligados a N, a MAN1B1 contribui para o controle de qualidade de glicoproteínas, a proteostase e o tráfego adequado pela via secretória. A desregulação da atividade de MAN1B1 tem sido associada a distúrbios congênitos da glicosilação, nos quais o processamento alterado de N-glicanos pode comprometer a maturação de receptores de superfície celular, a sinalização e a homeostase intracelular. Assim, MAN1B1 é frequentemente estudada no contexto de respostas ao estresse do RE, dinâmica de dobramento proteico e modulação da fisiologia celular dependente de glicanos.

MAN1B1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MAN1B1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MAN1B1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MAN1B1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MAN1B1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MAN1B1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MAN1B1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MAN1B1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MAN1B1 em células tumorais com expressão de MAN1B1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.