LRRK2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-426167-ACT

La leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) è una grande chinasi serina/treonina multidominio e una GTPasi che coordina il traffico vescicolare, l’omeostasi endolisosomiale, la dinamica del citoscheletro e l’autofagia attraverso interazioni con le GTPasi Rab e con le reti di segnalazione associate. Nelle cellule murine, l’attività di Lrrk2 influenza il rimodellamento, dipendente dalla fosforilazione, delle vie di traffico di membrana, collegando le risposte immunitarie innate e il controllo di qualità mitocondriale all’adattamento cellulare allo stress. La disregolazione della segnalazione di LRRK2 è stata ampiamente studiata nei meccanismi associati alla neurodegenerazione, inclusi un’alterata proteostasi, una compromessa funzione lisosomiale e una segnalazione infiammatoria aberrante. Queste caratteristiche rendono Lrrk2 un nodo utile per analizzare il crosstalk tra vie che coinvolgono il mantenimento neuronale, l’attivazione gliale e il trasporto intracellulare.

LRRK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lrrk2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRRK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lrrk2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lrrk2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRRK2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lrrk2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRRK2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRRK2 nelle cellule tumorali con espressione di Lrrk2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.