Plasmide CRISPR d'Activation (h) LASS2: sc-403112-ACT

Le gène humain CERS2 (également appelé LASS2) code la céramide synthase 2, une enzyme clé de la biosynthèse de novo des sphingolipides qui génère préférentiellement des céramides à très longue chaîne. En contrôlant la composition en longueurs de chaîne des céramides, LASS2 influence la biophysique membranaire, l’organisation des radeaux lipidiques et des processus de signalisation en aval liés à l’apoptose, l’autophagie et les réponses au stress. Le remodelage des sphingolipides dépendant de CERS2 s’intègre à l’homéostasie du réticulum endoplasmique (RE) et à la fonction mitochondriale, et peut moduler des voies affectant la croissance cellulaire, la différenciation et la signalisation inflammatoire. Une dérégulation du métabolisme des céramides impliquant CERS2 a été associée, dans des systèmes expérimentaux, à la biologie des cancers, à des dysfonctionnements métaboliques et à des mécanismes de maladies neurodégénératives ou hépatiques.

LASS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CERS2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LASS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CERS2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CERS2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LASS2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CERS2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LASS2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LASS2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CERS2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.