LASS2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403112-ACT

O CERS2 humano (também conhecido como LASS2) codifica a ceramida sintase 2, uma enzima-chave na biossíntese de esfingolipídios de novo que gera preferencialmente ceramidas de cadeia muito longa. Ao controlar a composição do comprimento de cadeia das ceramidas, o LASS2 influencia a biofísica de membranas, a organização de lipid rafts e processos de sinalização a jusante ligados à apoptose, autofagia e respostas ao estresse. A remodelação de esfingolipídios dependente de CERS2 integra-se à homeostase do RE (retículo endoplasmático) e à função mitocondrial e pode modular vias que afetam crescimento celular, diferenciação e sinalização inflamatória. A desregulação do metabolismo de ceramidas envolvendo CERS2 tem sido associada, em sistemas experimentais, à biologia do câncer, à disfunção metabólica e a mecanismos de doenças neurodegenerativas ou relacionadas ao fígado.

LASS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CERS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LASS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CERS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CERS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LASS2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CERS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LASS2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LASS2 em células tumorais com expressão de CERS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.