KV4.2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402801-ACT

KCND2 codifica la subunità del canale del potassio voltaggio-dipendente KV4.2, uno dei principali mediatori delle correnti di K+ di tipo A, rapide e transitorie, in neuroni e cardiomiociti. Modellando la ripolarizzazione del potenziale d’azione, l’adattamento della frequenza di scarica e i segnali a propagazione retrograda, KV4.2 influenza l’eccitabilità, l’integrazione sinaptica e la plasticità dipendente dall’attività, con una regolazione mediata da fosforilazione e da subunità ausiliarie come KChIPs e DPP6/10. Alterazioni dell’espressione o del gating del canale associate a KCND2 sono state collegate a fenotipi neurologici, inclusi epilessia e disturbi del neurosviluppo, e le dinamiche di ripolarizzazione dipendenti da KV4.2 sono rilevanti negli studi sulla suscettibilità alle aritmie e sull’elettrofisiologia cardiaca. Queste proprietà rendono KCND2 un bersaglio utile per investigare la biologia dei canali ionici, i circuiti dell’eccitabilità e le vie di segnalazione che modulano la conduttanza di membrana.

KV4.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCND2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KV4.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCND2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCND2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KV4.2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCND2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KV4.2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KV4.2 nelle cellule tumorali con espressione di KCND2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.