KLC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401881-ACT

O KLC1 humano (cadeia leve 1 da cinesina) codifica uma subunidade de cadeia leve do complexo motor cinesina-1, que conecta adaptadores de carga ao transporte baseado em microtúbulos. Ao atuar em parceria com as cadeias pesadas da cinesina e com proteínas de ligação à carga, o KLC1 sustenta o tráfego anterógrado de vesículas, organelas e complexos proteicos, essencial para a polaridade neuronal, o transporte axonal e o controle espacial da sinalização. O transporte dependente de KLC1 faz interface com vias que regulam o tráfego endossomal, a distribuição mitocondrial e a função sináptica, nas quais a entrega de carga comprometida pode perturbar a proteostase e as respostas ao estresse. Alterações na expressão de KLC1 ou no acoplamento de carga têm sido investigadas em neurodegeneração e em outros distúrbios que apresentam defeitos de transporte e tráfego intracelular desregulado.

KLC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KLC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KLC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KLC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KLC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KLC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KLC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KLC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KLC1 em células tumorais com expressão de KLC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.