KIR3.2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405031-ACT

KCNJ6 codifica a subunidade humana do canal de potássio retificador para dentro KIR3.2 (GIRK2), um efetor-chave da sinalização de receptores acoplados à proteína G que ajuda a estabilizar o potencial de membrana em repouso e a atenuar a excitabilidade celular. Após a ativação, o dímero Gβγ liberado por receptores acoplados a Gi/o promove a abertura do canal, acoplando entradas de neurotransmissores e neuromoduladores à condutância de potássio em neurônios e outras células excitáveis. O KIR3.2 contribui para a regulação do disparo de potenciais de ação, da integração sináptica e das oscilações de rede, ligando-o a vias que moldam respostas neurofisiológicas. A atividade ou expressão desregulada de KCNJ6 tem sido associada a alterações na sinalização neuronal e vem sendo investigada em contextos como fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, bem como suscetibilidade a crises epilépticas.

KIR3.2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNJ6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KIR3.2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNJ6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNJ6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KIR3.2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNJ6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KIR3.2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KIR3.2 em células tumorais com expressão de KCNJ6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.