Plasmide CRISPR d'Activation (h) IRE1α: sc-400576-ACT

ERN1 code l’enzyme 1 alpha dépendante de l’inositol (IRE1α), une kinase/endoribonucléase transmembranaire résidente du réticulum endoplasmique (RE) qui agit comme capteur central de la charge en protéines mal repliées et initie la réponse aux protéines mal repliées (UPR). En situation de stress du RE, IRE1α s’oligomérise et active son activité RNase afin d’épisser l’ARNm de XBP1 et de promouvoir des programmes transcriptionnels adaptatifs, tout en engageant également la dégradation régulée dépendante d’IRE1 (RIDD) pour moduler l’homéostasie des ARNm. Par un dialogue avec les voies de signalisation PERK et ATF6, ERN1 coordonne la protéostasie, le métabolisme lipidique et la signalisation inflammatoire, influençant les décisions de destinée cellulaire entre adaptation et apoptose. Une activité dérégulée de l’axe IRE1α–XBP1 a été impliquée dans des contextes tels que la survie des cellules tumorales sous stress, les dysfonctionnements métaboliques et la neurodégénérescence, faisant d’ERN1 un nœud largement utilisé pour des études mécanistiques de la biologie du stress du RE.

IRE1α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IRE1α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IRE1α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IRE1α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IRE1α dans les cellules tumorales présentant une expression de ERN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.