IRBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403810-ACT

RBP3 codifica a proteína de ligação a retinoides do inter-fotorreceptor (IRBP), uma glicoproteína secretada enriquecida na matriz inter-fotorreceptora, onde se liga a retinoides e os transporta entre os fotorreceptores e o epitélio pigmentar da retina (EPR) para dar suporte ao ciclo visual (de retinoides). Ao regular a disponibilidade e o tráfego de retinoides 11-cis e all-trans, a IRBP ajuda a manter a homeostase dos fotorreceptores e influencia as respostas ao estresse oxidativo e metabólico na retina externa. Alterações na expressão ou na função de RBP3/IRBP estão associadas a fenótipos de disfunção e degeneração retinianas, tornando-o uma ferramenta molecular útil para investigar o acoplamento fotorreceptor–EPR, a biologia da matriz extracelular e a sinalização dependente de retinoides. Por isso, RBP3 é comumente estudado em modelos de doença retiniana hereditária e adquirida para dissecar mecanismos de desequilíbrio do ciclo visual e vulnerabilidade dos fotorreceptores.

IRBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RBP3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IRBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RBP3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RBP3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IRBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RBP3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IRBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IRBP em células tumorais com expressão de RBP3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.