INCENP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403186-ACT

INCENP (proteína do centrômero interno) é um componente central do complexo passageiro cromossômico, que coordena o alinhamento dos cromossomos na mitose, a sinalização do checkpoint de montagem do fuso e a citocinese. Por meio do acoplamento funcional com a quinase Aurora B, Survivin (BIRC5) e Borealin (CDCA8), a INCENP ajuda a regular as ligações entre cinetócoro e microtúbulos, a fosforilação da histona H3 e a correção de interações errôneas do fuso. Assim, a atividade adequada da INCENP é essencial para a segregação fiel dos cromossomos e a manutenção da estabilidade genômica durante a divisão celular. A desregulação da sinalização do complexo passageiro cromossômico está associada à aneuploidia e a fenótipos proliferativos relevantes para a biologia do câncer e outros contextos de instabilidade cromossômica.

INCENP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de INCENP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

INCENP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus INCENP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição INCENP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de INCENP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus INCENP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de INCENP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via INCENP em células tumorais com expressão de INCENP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.