Plasmide CRISPR d'Activation (h) IAP: sc-401544-ACT

L’ALPI humain code la phosphatase alcaline intestinale (IAP), une enzyme de la bordure en brosse ancrée via un glycosylphosphatidylinositol, qui hydrolyse les monoesters phosphatés et déphosphoryle, dans la lumière intestinale, des ligands associés aux microorganismes. En modulant les pools de nucléotides luminales et en détoxifiant des molécules phosphorylées pro-inflammatoires, l’IAP contribue à l’homéostasie de la barrière épithéliale, à la signalisation de l’immunité innée au niveau muqueux et à l’écologie microbienne. L’activité d’ALPI est liée à des processus de différenciation intestinale et de fonction des entérocytes, en interaction avec des voies qui façonnent le tonus inflammatoire et la gestion des nutriments à la surface muqueuse. Une expression ou une activité dysrégulée d’ALPI a été associée à des phénotypes inflammatoires intestinaux et à des interactions hôte–microbiote altérées, pertinentes pour des modèles de maladies gastro-intestinales.

IAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALPI sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALPI dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALPI, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALPI natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IAP dans les cellules tumorales présentant une expression de ALPI silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.