Plasmide CRISPR d'Activation (m) HXK II: sc-420866-ACT

Le gène murin Hk2 code l’hexokinase II (HXK II), une enzyme limitante de la vitesse qui phosphoryle le glucose en glucose-6-phosphate à l’entrée de la glycolyse, contrôlant ainsi le flux de carbone vers la production d’énergie et les voies biosynthétiques. La fonction de HXK II relie l’utilisation du glucose au métabolisme mitochondrial et peut influencer l’équilibre entre la glycolyse et la phosphorylation oxydative, avec des effets en aval sur la production d’ATP, l’homéostasie rédox et l’approvisionnement en précurseurs anaboliques. Dans de nombreux types cellulaires, l’expression de HK2 est régulée par des réseaux de signalisation sensibles aux nutriments et aux facteurs de croissance, notamment les voies PI3K–AKT et des programmes dépendants de HIF qui coordonnent l’adaptation métabolique. Des modifications de l’activité et de l’expression de HK2 sont largement utilisées comme indicateurs d’une reprogrammation métabolique associée à des états prolifératifs et d’adaptation au stress dans des modèles d’inflammation, de neurodégénérescence et de biologie tumorale.

HXK II Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hk2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HXK II Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hk2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hk2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HXK II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hk2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HXK II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HXK II dans les cellules tumorales présentant une expression de Hk2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.