HSPA5/BiP/GRP78 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400073-ACT

HSPA5 codifica a chaperona do retículo endoplasmático (RE) BiP/GRP78, um regulador central do dobramento de proteínas, do controle de qualidade no RE e da proteostase. HSPA5 liga-se a polipeptídeos recém-sintetizados e a proteínas mal dobradas, coordena a degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD) e modula a sinalização da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) por meio de sensores-chave, incluindo PERK, IRE1 e ATF6. Ao integrar o estresse do RE à homeostase do cálcio, ao equilíbrio redox e à capacidade de fluxo da via secretória, HSPA5 influencia a sobrevivência celular e a adaptação metabólica. A expressão desregulada de HSPA5 e a ativação da UPR estão implicadas na tolerância ao estresse em câncer, em proteinopatias neurodegenerativas, no estresse do RE relacionado ao diabetes e em estados inflamatórios.

HSPA5/BiP/GRP78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HSPA5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HSPA5/BiP/GRP78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HSPA5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HSPA5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HSPA5/BiP/GRP78. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HSPA5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HSPA5/BiP/GRP78 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HSPA5/BiP/GRP78 em células tumorais com expressão de HSPA5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.