HCN2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405074-ACT

HCN2 kodiert den hyperpolarisationsaktivierten, zyklische Nukleotide steuernden Kanal 2 (HCN2), eine porenbildende Untereinheit, die den Ih-Strom leitet und die Hyperpolarisation der Membran mit einem depolarisierenden einwärts gerichteten Kationenfluss koppelt. Durch die Integration von Spannungssensorik und direkter Modulation durch zyklische Nukleotide trägt HCN2 zur Feinabstimmung neuronaler Erregbarkeit, Schrittmacheraktivität und rhythmischer Entladungseigenschaften bei und beeinflusst dadurch Signalintegration und Netzwerkoszillationen. Die HCN2-Funktion überschneidet sich mit cAMP/PKA-gekoppelten Signalwegen und umfassenderen elektrophysiologischen Programmen, die synaptische Responsivität und eine erregbarkeitsabhängige Genregulation prägen. Eine fehlregulierte HCN2-Expression oder Kanalaktivität wurde mit veränderten Erregbarkeitsphänotypen in Verbindung gebracht, die für Erkrankungen des Nervensystems und des sensorischen Systems relevant sind, was mechanistische Studien in erregbaren Geweben und krankheitsrelevanten Zellmodellen unterstützt.

HCN2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HCN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HCN2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HCN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HCN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HCN2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HCN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HCN2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HCN2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HCN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.