HCN2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405074-ACT

HCN2 codifica o canal 2 ativado por hiperpolarização e regulado por nucleótidos cíclicos (Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated channel 2), uma subunidade formadora de poro que conduz a corrente Ih e liga a hiperpolarização da membrana a um fluxo de entrada despolarizante de catiões. Ao integrar a deteção de voltagem com a modulação direta por nucleótidos cíclicos, o HCN2 ajuda a ajustar a excitabilidade neuronal, a atividade marcapasso e as propriedades de disparo rítmico, influenciando a integração de sinais e as oscilações de rede. A função do HCN2 cruza-se com a sinalização ligada a cAMP/PKA e com programas eletrofisiológicos mais amplos que moldam a responsividade sináptica e a regulação génica dependente da excitabilidade. A desregulação da expressão de HCN2 ou da atividade do canal tem sido associada a fenótipos de excitabilidade alterada relevantes para perturbações neurológicas e do sistema sensorial, apoiando estudos mecanísticos em tecidos excitáveis e em modelos celulares relevantes para a doença.

HCN2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HCN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HCN2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HCN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HCN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HCN2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HCN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HCN2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HCN2 em células tumorais com expressão de HCN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.