Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR41: sc-402190-ACT

FFAR3 code pour le récepteur couplé aux protéines G GPR41, un capteur de surface cellulaire des acides gras à chaîne courte tels que le propionate et le butyrate issus de la fermentation microbienne. Après liaison du ligand, GPR41 se couple principalement aux voies de signalisation Gi/o, ce qui réduit l’AMPc et module des voies en aval influençant le métabolisme cellulaire, l’homéostasie énergétique et le tonus inflammatoire. L’activité de FFAR3/GPR41 a été associée à la régulation de la sécrétion hormonale et à la communication neuro-immune, le plaçant à l’interface entre la signalisation intestin–microbiome et la physiologie de l’hôte. Une signalisation FFAR3 dérégulée présente donc un intérêt pour l’étude des dysfonctionnements métaboliques et des mécanismes des maladies inflammatoires, lorsque la détection des nutriments médiée par les GPCR est perturbée.

GPR41 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FFAR3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR41 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FFAR3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FFAR3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR41. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FFAR3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR41 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR41 dans les cellules tumorales présentant une expression de FFAR3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.