GPR40 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401434-ACT

ヒトFFAR1（GPR40）は、中鎖および長鎖の遊離脂肪酸に対するGタンパク質共役受容体（GPCR）をコードしており、主としてGq/11に共役してホスホリパーゼC（PLC）シグナル伝達、細胞内Ca2+動員、ならびに下流のPKC/MAPK経路活性を促進する。膵島生物学においてGPR40は、栄養由来脂質の感知をグルコース刺激性インスリン分泌の調節へと結び付け、さらに腸内分泌細胞をはじめとする代謝活性の高い他の細胞種における脂質応答性シグナルにも寄与する。FFAR1/GPR40活性の変化は、肥満や2型糖尿病などの代謝ストレスの文脈で研究されており、脂肪酸駆動性シグナルが内分泌系と炎症系のクロストークに影響し得ることが示されている。脂質シグナルを転写および分泌アウトプットと統合する膜受容体として、FFAR1はGPCRシグナル伝達ダイナミクス、セカンドメッセンジャー応答、ならびに代謝経路の制御を解析する目的でしばしば用いられる。

GPR40 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性FFAR1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GPR40 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における FFAR1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はFFAR1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GPR40の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のFFAR1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGPR40依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびFFAR1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGPR40経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。