Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR40: sc-401434-ACT

Le FFAR1 (GPR40) humain code un récepteur couplé aux protéines G pour les acides gras libres à chaîne moyenne et longue, qui s’associe principalement à Gq/11 afin de stimuler la signalisation de la phospholipase C, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et l’activité en aval de la voie PKC/MAPK. En biologie des îlots pancréatiques, GPR40 relie la détection des lipides nutritionnels à la modulation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et contribue également à une signalisation sensible aux lipides dans les cellules entéroendocrines et d’autres types cellulaires métaboliquement actifs. Une activité altérée de FFAR1/GPR40 a été étudiée dans le contexte du stress métabolique, notamment l’obésité et le diabète de type 2, où la signalisation induite par les acides gras peut influencer les interactions entre voies endocrines et inflammatoires. En tant que récepteur membranaire intégrant des signaux lipidiques à des sorties transcriptionnelles et sécrétoires, FFAR1 est fréquemment utilisé pour étudier la dynamique de la signalisation des GPCR, les réponses des seconds messagers et la régulation des voies métaboliques.

GPR40 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FFAR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR40 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FFAR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FFAR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR40. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FFAR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR40 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR40 dans les cellules tumorales présentant une expression de FFAR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.