GlcNAc kinase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407809-ACT

NAGK codifica a quinase humana de GlcNAc, uma enzima citosólica que fosforila a N-acetilglucosamina em GlcNAc-6-fosfato, conectando a via de reaproveitamento (salvage) de GlcNAc ao metabolismo das hexosaminas. Essa atividade contribui para a geração de UDP-GlcNAc, um substrato doador central para a glicosilação N- e O-ligada e outros processos dependentes de glicanos que regulam o dobramento de proteínas, o tráfego intracelular e a transdução de sinais. Ao influenciar a capacidade de glicosilação, a NAGK pode afetar as respostas celulares à disponibilidade de nutrientes e ao estresse, com efeitos a jusante sobre programas de crescimento e diferenciação celular. Fluxo desregulado da via das hexosaminas e alterações de glicosilação são características recorrentes em contextos de doenças metabólicas e proliferativas, tornando a NAGK um ponto útil para investigações mecanísticas de vias.

GlcNAc kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NAGK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GlcNAc kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NAGK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NAGK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GlcNAc kinase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NAGK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GlcNAc kinase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GlcNAc kinase em células tumorais com expressão de NAGK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.