GFAT1 CRISPR/Cas9 KO质粒 (h): sc-403022

概述

GFPT1 编码谷氨酰胺—果糖-6-磷酸酰胺转移酶 1（GFAT1）。GFAT1 是己糖胺生物合成途径的限速酶，催化果糖-6-磷酸与谷氨酰胺生成氨基葡萄糖-6-磷酸。通过调控进入 UDP-GlcNAc 生成的代谢通量，GFAT1 将葡萄糖和氨基酸的可用性与蛋白质 N-连接糖基化、O-GlcNAc 化以及蛋白聚糖生物合成相联系，从而影响内质网（ER）蛋白稳态、信号传导以及细胞外基质调控。GFPT1/GFAT1 活性改变与蛋白糖基化失衡和代谢应激反应异常相关，这与神经肌肉表型有关，也与更广泛的葡萄糖感知及翻译后修饰调控研究相关。该基因常在糖链依赖的转运与信号发生改变、进而重塑细胞状态与存活能力的研究背景中被重点关注。

GFAT1 CRISPR/Cas9 敲除质粒（h）是一组质粒池，旨在针对性地破坏human细胞系中的GFPT1基因。该文库中的每个质粒均共表达一种独特的sgRNA，针对GFPT1基因座内的不同位点，同时表达来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶，并编码GFP以实现对成功转染细胞的荧光识别和富集。这种多引导策略提高了诱导产生功能性敲除的移码突变或缺失的概率，为单引导策略提供了更可靠的替代方案。在多个位点诱导的双链断裂（DSBs）可通过非同源末端连接（NHEJ）修复，或者当与随附的HDR供体模板配合使用时，可在基因座内的特定靶位点通过同源导向修复（HDR）进行修复。

若与表达 RFP 的 HDR 供体结合使用，可同时利用 GFP 和 RFP 荧光区分转染细胞群与编辑后的细胞群，从而简化基于流式细胞术的分选和克隆筛选工作流程。

同源导向修复 (HDR) 供体 — 含 RFP 报告基因的嘌呤霉素抗性 cassete

对于需要确认且可筛选的敲除克隆的应用，GFAT1 HDR质粒（h）包含一个HDR供体构建体，其中含有嘧啶霉素抗性盒（PuroR）和红色荧光蛋白（RFP）报告基因，两侧由针对特定GFPT1靶位点的同源臂包围。
与 GFAT1 CRISPR/Cas9 敲除质粒（h）共转染时：

• PuroR-RFP 片段通过同源重组（HDR）整合到 Cas9 切割位点，从而破坏 GFPT1 的开放阅读框。
  RFP 荧光可作为整合成功的即时视觉指示，支持在嘌呤霉素筛选之前或同时，基于荧光对编辑后的细胞进行鉴定或分选。
  通过嘌呤霉素抗性可确认编辑成功的细胞，从而大幅减轻克隆筛选的工作量。
  该筛选策略非常适合构建稳定的克隆性敲除细胞系，用于下游的功能研究、药物筛选或模型开发。

Cre-lox 盒去除系统

HDR 供体构建体的loxP 位点位于 PuroR-RFP 选择盒的侧翼，可在克隆确认后干净利落地去除标记。通过随附的Cre 载体：sc-418923，瞬时表达 Cre 重组酶，切除基因盒，在GFPT1 基因座内留下最小的残留 loxP 位点，消除对下游检测的潜在干扰效应。
这种两步法

• 最大限度减少对局部染色质结构及邻近调控元件的干扰
  在编辑位点恢复近乎天然的基因组环境
  支持在同一细胞系中重复使用嘌呤霉素筛选策略进行后续编辑

主要特点

• gRNA靶向对GFAT1功能至关重要的GFPT1外显子
  SpCas9与sgRNA由单一质粒共表达，简化递送流程
  含嘌呤霉素抗性的HDR供体，便于阳性克隆筛选
  由Cre重组酶载体携带的loxP夹杂PuroR盒，实现无缝标记去除
  提供转染即用型

仅供研究使用。不用于诊断或治疗。