GCN2 CRISPR Activationプラスミド (m): sc-424196-ACT

マウスのEif2ak4はGCN2をコードしており、GCN2は非荷電tRNAとの結合によってアミノ酸欠乏を感知し、統合ストレス応答（integrated stress response）を開始するセリン／スレオニン型タンパク質キナーゼです。活性化されると、GCN2はeIF2αをリン酸化して全体的な翻訳を抑制する一方、ATF4依存的転写などの選択的な翻訳プログラムを促進し、栄養ストレスを適応的代謝およびレドックス制御へと結び付けます。この経路は、mTORC1シグナル伝達、オートファジー制御、ならびにプロテオスタシスの破綻時におけるリボソーム関連品質管理（ribosome-associated quality control）とも交差します。GCN2シグナルの異常は、炎症性および代謝性の表現型、神経変性に関連するストレス応答、さらには栄養の乏しい微小環境への腫瘍細胞の適応に関与するとされており、ストレス生物学の機構研究における有用性を支持しています。

GCN2 CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Eif2ak4の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GCN2 CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Eif2ak4 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はEif2ak4転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GCN2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のEif2ak4遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGCN2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびEif2ak4発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGCN2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。