GC-C Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403413-ACT

O GUCY2C humano codifica a guanilato ciclase C (GC-C), um recetor da membrana apical e uma guanilil ciclase particulada que catalisa a produção de cGMP em resposta a peptídeos endógenos do tipo guanilina e a enterotoxinas no epitélio intestinal. A sinalização de cGMP conduzida por GC-C regula a secreção de cloreto e bicarbonato dependente de CFTR, o equilíbrio de fluidos epiteliais, a função de barreira e programas de proliferação–diferenciação através de efetores a jusante, incluindo PKG e vias reguladas por nucleótidos cíclicos. Este eixo de sinalização integra-se com a homeostase intestinal e as respostas inflamatórias, e alterações na expressão ou na sinalização de GUCY2C têm sido associadas à fisiopatologia gastrointestinal e a estados epiteliais associados a tumores. Como recetor de membrana com regulação transcricional dependente do contexto, a GC-C é frequentemente estudada em sinalização epitelial, imunologia da mucosa e interação entre vias oncogénicas.

GC-C O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GUCY2C sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GC-C O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GUCY2C em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GUCY2C, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GC-C. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GUCY2C nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GC-C no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GC-C em células tumorais com expressão de GUCY2C silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.