GAP-43 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400632-ACT

O gene humano GAP43 codifica a GAP-43, uma fosfoproteína associada ao crescimento, enriquecida em neurônios, que regula o crescimento axonal, a motilidade do cone de crescimento e a remodelação sináptica. A GAP-43 é um substrato proeminente da PKC e integra a sinalização dependente de cálcio com a dinâmica de membrana por meio de interações com a calmodulina e fosfolipídios, conectando-se à reorganização do citoesqueleto e a programas de extensão de neuritos. Sua expressão é regulada ao longo do desenvolvimento e é reinduzida durante respostas a lesões nervosas, dando suporte a estudos de plasticidade e regeneração neuronal. A atividade ou expressão desregulada de GAP-43 tem sido associada a alterações na conectividade sináptica e tem sido investigada no contexto de mecanismos de doenças do neurodesenvolvimento e neurodegenerativas.

GAP-43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GAP43 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GAP-43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GAP43 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GAP43, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GAP-43. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GAP43 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GAP-43 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GAP-43 em células tumorais com expressão de GAP43 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.